复苏活率低，贴壁不牢，容易分化？iPSC贴壁培养的坑，你踩了几个？
你有没有过这样的经历？
- 满怀期待地复苏了一管细胞，第二天一看：贴壁的寥寥无几，培养皿里漂着一层“碎片”。
- 养了好几天的克隆，边缘开始松散、中心发暗，一不留神，自发分化了。
- 明明按照同一个方案做，换个人、换个批次，细胞状态就是不一样，结果怎么都重复不出来。
如果你刚接触iPSC培养，或者对贴壁状态、传代时机、操作细节总是拿不准，与其盲猜，不如直接看一遍“标准答案”。
看完视频，我们再送上一份福利小贴士：
我们把实验中容易被忽视的细节也整理成了一份避坑清单，你可以对照看看，自己中了几条。
1、Q：iPSC贴壁培养对培养箱环境有什么要求？
A：iPSC的培养条件为36–38°C，5% CO₂ 湿润空气，避光，尤其是培养多种细胞的实验室，要注意核对和调整培养箱温度和气体，此外，可在培养箱内放盛水托盘，定期查看和补水，维持湿度。
2、Q：日常培养基使用有哪些容易忽略的细节？
A：复苏、传代和日常换液都使用预热过的培养基，避免冷培养基对细胞的刺激；日常要多留意培养基和试剂状态，发现异常或超过有效期，勿再使用；此外，完全培养基不要一次配太多，以防长期反复使用引入污染，应根据每次用量合理配制。
3、Q：冷冻添加剂和完全培养基配制要注意什么？
A：冷冻添加剂应在 2–8°C 温和溶解，不要37°C溶解，否则可能破坏其中的rh bFGF、rh TGFβ 等活性成分，导致培养基支持多能性的能力下降。添加剂需轻轻混匀后缓慢加入基础培养基并轻晃混匀，保证培养基的均一。
4、Q：复苏细胞时，水浴和洗涤环节怎么操作更稳妥？
A：细胞不要融化过久，否则会增加冰晶损伤和DMSO毒性，应用37°C 水浴迅速（<2 分钟）溶解冻存的细胞，当冰快完全融化时即从水浴中移出细胞冻存管，不要等完全升温。复苏后的细胞应洗涤，这样可以避免残留冻存液中的DMSO损伤细胞，操作时可以将溶解后的细胞悬液转移至 15 ml 无菌离心管，缓慢加入预热过的培养基，离心后去除上清，从而洗涤细胞。
5、Q：传代时有什么需要注意的细节？
A：传代时应使用不含钙镁离子的DPBS冲洗单层细胞，再吸除漂洗液，因为钙镁离子的存在会干扰EDTA或消化液作用；消化的时间要控制好，在团块传代时，不要等到细胞完全分散，在细胞团表面的细胞有点变圆时即撤掉消化液，再用细胞刮把整团细胞刮下来；单细胞传代时，加入消化液后显微镜下确认细胞完全脱落后再终止，不要靠猛吹打散，传代后24小时内，需要添加Y-27632。
iPSC培养的稳定性，靠的从来不是“差不多”，而是每一个细节都按规范来。如果你身边有其他正在做iPSC培养的小伙伴，转发给TA，说不定能帮TA避开一次“翻车”。
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