拒绝“娇贵”！人原代肝细胞 (hPHs) 从分离到培养的避坑指南
在体外细胞培养的鄙视链里，人原代肝脏细胞（Human Primary Hepatocytes, hPHs） 几乎算得上是“顶流”级别的存在。它不仅是肝脏体外研究的“金标准”，更是出了名的“娇贵”——分离难度大、极易去分化、对培养环境要求严苛。
今天，源仔博士就从原代肝细胞的底层逻辑出发，为您拆解从组织分离到体外培养的通关秘籍，重点聊聊如何通过精准的操作与专属培养基，让您的肝细胞获得极高的纯度，并在培养皿里“超长待机”。
一、认识“顶流”：什么是人原代肝脏细胞？
人原代肝脏细胞，是直接从人体肝脏组织中分离出来的实质细胞。与 HepG2、Huh7 等经过永生化处理的肝癌细胞系不同，原代肝细胞最大限度地保留了人体肝脏的生理学特征、代谢功能和复杂的酶学活性。
应用领域：为什么大家都离不开它？
- 药物代谢与药代动力学 (DMPK)： 评估新药在人体内的代谢途径、清除率及药物相互作用（DDI）。
- 毒理学评估： 筛选药物的肝脏毒性（Hepatotoxicity），这是新药研发中极其关键的一环。
- 疾病模型构建： 用于非酒精性脂肪肝 (NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 以及病毒感染等体外模型的建立。
二、追本溯源：如何“淘”出高纯度、高活性的肝实质细胞？
想要养好肝细胞，第 1 步也是最困难的一步，就是从致密的肝脏组织中将实质细胞完好无损地剥离出来。目前业内公认的黄金标准是“两步胶原酶灌流法”（Two-step Collagenase Perfusion），配合精准的离心工艺。
1. 第 1 步：无钙灌流（破坏细胞间连接）
肝细胞之间通过桥粒（Desmosomes）紧密连接，而桥粒的维持高度依赖钙离子。
- 方法：使用含有肝素和EDTA（钙离子螯合剂）且无钙无镁的平衡盐溶液（如 D-PBS 或 HBSS）对肝脏组织进行灌流或洗涤。
- 原理：迅速“抽干”环境中的钙离子，使得细胞间的紧密连接松动，为后续的酶促消化打开通道。
2. 第 2 步：胶原酶消化（瓦解细胞外基质）
- 方法：切换为含有钙离子和高质量胶原酶（通常为 Collagenase IV 或专用肝细胞分离酶）的灌流液进行消化。
- 原理：钙离子负责激活胶原酶的活性，精准降解包围在细胞周围的胶原蛋白网络。
- 要点：酶的消化时间与浓度比较考验操作者经验。消化不足，细胞无法释放；消化过度，细胞膜破损，会导致复苏活率下降。建议使用批次间稳定性好的胶原酶。
3. 第 3 步：纯化与富集（剔除“杂牌军”）
消化后的液体是一锅“大杂烩”，包含肝实质细胞（hPHs）、非实质细胞（如 Kupffer 细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞）以及大量死细胞碎片。
- 粗分离-低速离心富集：肝脏实质细胞体积大、密度高。通过低速离心（50g，3-5分钟），实质细胞会迅速沉底，而上清液中的非实质细胞和碎片则被轻松去掉。可以采用含percoll或碘克沙醇洗涤液二次离心或肝细胞清洗液（内含白蛋白和N-乙酰半胱氨酸）一步离心。
- 进阶纯化-碘克沙醇密度梯度离心：若对肝实质细胞纯度有更高要求，可继续使用percoll或碘克沙醇进行系列密度梯度分离。活的实质细胞会穿过特定的密度层，而死细胞和碎片会被拦截在不同密度层，从而轻松获得纯度＞90%、活率较高的各种原代肝细胞。
三、迎难而上：人原代肝细胞分离及培养步骤
经历了严苛的分离过程，细胞非常脆弱，最容易出现去分化和特异性酶（如 CYP450 家族）活性快速下降。
1. 细胞复苏和铺板（Thawing and Plating）
- 前置准备：肝细胞自己很难直接抓牢培养皿。强烈建议使用 I 型胶原蛋白（Collagen I）提前包被培养板，提供贴壁的物理支撑。
- 铺板密度：极度关键！密度过低，细胞间缺乏通讯极易死亡；密度过高，细胞容易堆积脱落。通常推荐密度为1.5×105 到3×105 cells/cm²，形成单层致密网络。
- 使用 Thawing and Plating Medium，最大限度保证肝细胞的活力和贴壁效率。
2. 状态维持与“三明治”培养法 (Sandwich Culture)
- 维持培养：铺板后 4-6 小时，健康的细胞应已贴壁，此时必须轻轻吸除死细胞，换上维持培养基。
- “三明治”培养法：在细胞贴壁形成单层后，在细胞上方再覆盖一层基质胶，如 Matrigel 或 I 型胶原，将细胞“夹”在中间。这能让细胞保持立体的极性（形成毛细胆管网络），长期维持 CYP 酶活性。
四、核心利器：用对培养基，事半功倍
养好原代肝细胞，本质上是为其重塑一个体外微环境。作为专业的细胞培养基供应商，源培生物为您拆解铺板与维持阶段不同的培养基配方逻辑：
1. 复苏和铺板培养基 (Thawing and Plating Medium)：助力快速“安家”
细胞刚经历过分离应激或冻存复苏，需要高能量、高营养的物质帮它快速贴壁。
- 基础培养基： 通常以 Williams' E 为底物，富含多种氨基酸和维生素。
- 核心添加剂：
> 胎牛血清 (FBS)：添加 5%-10%。血清中的促贴壁因子是早期存活的关键。
> 地塞米松 (Dexamethasone) & 胰岛素 (Insulin)：抑制成纤维细胞增殖，提供代谢能量。
> Hepes与丙氨酰-谷氨酰胺
2. 维持培养基 (Maintenance Medium)：保持纯正“血统”
一旦细胞贴壁成功，必须立刻撤掉血清！因为血清会导致肝细胞快速去分化。
- 黄金添加剂组合：
> ITS 补充液 (Insulin-Transferrin-Selenium)： 无血清条件下的黄金搭档。胰岛素调节代谢，转铁蛋白运输铁离子，硒作为抗氧化剂保护细胞免受自由基损伤。
> 高浓度地塞米松： 持续维持 CYP450 酶的表达水平。
> HEPES 与丙氨酰-谷氨酰胺： HEPES 强效缓冲 pH 变化；丙氨酰-谷氨酰胺替代传统谷氨酰胺，避免产生对肝细胞有毒性的氨。
五、源培生物肝细胞培养解决方案
从第 1 步的组织灌流，到最后一步的长期维持，我们为您提供高品质、批次稳定的人原代肝细胞培养全流程体系：
✔️ 无钙灌流液（使用前需添加肝素）：严控内毒素水平，为高活率的分离打下坚实基础。
✔️ 含钙HBSS（使用前需加入IV型胶原酶）
✔️ 肝细胞清洗液
✔️ 原代肝细胞复苏和铺板培养基（CHT&P Medium）：精准配比的血清与促贴壁因子，复苏与分离贴壁率显著提升。
✔️ 原代肝细胞无血清维持培养基（PHM Medium）：优化的 ITS 与激素组合，完美支持“三明治”培养，也可支持原代肝细胞3D成球培养。
- 实验步骤及推荐产品
结语
原代肝细胞从分离到培养是一门精细的艺术，而优质培养基与配套试剂就是您手中最得心应手的画笔。如果您在肝细胞分离纯化、复苏贴壁或酶活维持上遇到了任何瓶颈，欢迎与我们探讨，或直接联系源培生物市场部获取技术支持。
